使用機(jī)械或化學(xué)方法提取生物樣本中的蛋白質(zhì)， 定量總蛋白，樣品與緩沖液混合，然后裝在凝膠上進(jìn)行電泳。

注意事項(xiàng)：

> 蛋白質(zhì)在樣品處理過程應(yīng)在低溫下進(jìn)行，以避免細(xì)胞破碎釋放出的各種酶類的修飾（加入合適的蛋白酶抑制劑）。

> 樣品建議分裝成合適的量（比如分裝出 20μL 檢測蛋白質(zhì)定量用），然后 -20°或 -80℃中長期保存，注意不要反復(fù)凍融，因?yàn)闀?huì)使蛋白的抗原特性發(fā)生改變。

> 切莫使用不新鮮的上樣緩沖液，同時(shí)在處理時(shí)應(yīng)注意將樣品與 loading buffer 混合均勻。

蛋白樣品被裝載到凝膠上，通過電泳將它們按大小分開。

注意事項(xiàng)：

> 配膠試劑里面的 AP 需要根據(jù)實(shí)驗(yàn)室實(shí)際溫度來適量的增加或者減少，比如夏天溫度較高, 自然凝膠速度較快，AP 的量需要適當(dāng)?shù)臏p少；冬天溫度低，凝膠慢，需要適量的增加。

> 灌膠時(shí)掌握好速度，避免氣泡產(chǎn)生（注意濃度越小的膠含水越多，凝固后膠體積縮小越多）。加水液封時(shí)速度要很慢，否則膠會(huì)被沖變形。

> 所有的蛋白樣品定量一致，體積一致，不夠的用裂解液補(bǔ)足，樣品兩側(cè)的泳道用等體積 的1×Loading Buffer 上樣，Marker也用1×Loading Buffer調(diào)制與樣品等體積，這樣可以避免出現(xiàn)誤差。

> 加樣前可用 5mL 注射器或加樣器先沖洗一下加樣孔。加入下一個(gè)樣品前，進(jìn)樣器需在外槽電泳緩沖液中洗滌 3 次，以免交叉污染。上樣時(shí)，小心不要使樣品溢出而污染相臨加樣孔。

> 電泳時(shí)間和電壓說法各異。一般電泳至溴酚蘭剛跑出即可終止電泳，進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。為減少蛋白質(zhì)條帶的擴(kuò)散，上樣后應(yīng)盡快進(jìn)行電泳，電泳結(jié)束后也應(yīng)直接或者轉(zhuǎn)印。

將蛋白從凝膠基質(zhì)移動(dòng)到合成膜支持物上，并與膜相結(jié)合，形成印跡。

注意事項(xiàng)：

> 選擇合適的膜和緩沖液是確保蛋白轉(zhuǎn)印成功的關(guān)鍵。必須通盤考慮蛋白質(zhì)的大小和電荷、轉(zhuǎn)印方法和膜 的結(jié)合特性。

> 切濾紙和膜時(shí)一定要戴干凈手套，因?yàn)槭稚系牡鞍讜?huì)污染膜。PVDF 膜使用前用無水甲醇中浸泡 1min~2min。

> 在加有轉(zhuǎn)移液的培養(yǎng)皿里放入裁好的膠、浸過甲醇的 PVDF 膜和濾紙，平衡 10min左右，也是為了除去濾紙和轉(zhuǎn)移膜中的氣泡以及膠上多余的 SDS。

> 用槍頭或移液管在疊層的濾紙上滾動(dòng)，除去氣泡。注意每疊一層就要用玻璃棒或圓筒試管趕去氣泡，因?yàn)橐粋€(gè)氣泡的厚度對(duì)于蛋白來說都是十萬八千里的。

> 用干凈紗布將疊層上面和周圍的多余緩沖液吸干。這一步很重要，寧可太干也不能太濕，太干容易燒胡，太濕的話多余的緩沖液會(huì)導(dǎo)致電流短路，大大降低轉(zhuǎn)移效率，如果同時(shí)轉(zhuǎn)好幾條膠的時(shí)候更要小心，有一個(gè)膠短路就會(huì)影響整體的轉(zhuǎn)移效率。

對(duì)轉(zhuǎn)印后的膜進(jìn)行封閉，阻斷膜上未結(jié)合位點(diǎn)，以防止與抗體的非特異性結(jié)合。

注意事項(xiàng):

> 做磷酸化蛋白的western時(shí)使用BSA（牛血清蛋白）作為封閉液。奶粉含有酪蛋白（一種磷酸化蛋白），如果用奶粉，有可能出現(xiàn)背景深的現(xiàn)象。并且脫脂奶粉含磷酸酶，磷酸酶與膜上的磷酸化蛋白接觸可使之去磷酸化，用磷酸化特異性抗體分析磷酸化蛋白時(shí)會(huì)受到影響。

膜首先與一種特異性針對(duì)目標(biāo)蛋白上一個(gè)抗原表位的初級(jí)抗體孵育。經(jīng)過幾次洗滌后，隨后會(huì)與一個(gè)標(biāo)記的二級(jí)抗體孵育，以提供檢測的手段。

注意事項(xiàng)：

> 為減少非特異結(jié)合,可選用封閉液作為一抗和二抗的抗體稀釋液。

> 一抗孵育條件推薦 4°C過夜, 二抗孵育條件為室溫,1h。

> 洗滌液推薦選用 TBST 緩沖液。洗滌時(shí)應(yīng)保持適中的搖床速度,避免過快導(dǎo)致膜上的蛋白 或抗體脫落,同時(shí)確保洗滌液能夠充分接觸到膜上的每一個(gè)角落。在洗滌過程中,適時(shí)更換 新的洗滌液以確保洗滌效果。

> 洗滌過程中需要保持膜的濕潤,避免膜干燥導(dǎo)致抗體結(jié)合力下降或蛋白變性。

將膜清洗以移除未結(jié)合的抗體后，使用二抗上的標(biāo)簽來可視化感興趣的蛋白?？贵w可以標(biāo)記有產(chǎn)生顏色和光的酶，或者直接用熒光標(biāo)記來可視化蛋白。

注意事項(xiàng)： 

> 采用暗室膠片曝光方法，操作需要盡量熟練，除了要把握曝光時(shí)間，還要避免位移（壓片、取片過程中膠片和雜交膜不能有移動(dòng)）；保留好膠片，作為原始憑證；

> 使用化學(xué)發(fā)光成像儀采集圖像，注意采集白光下的圖像，并與發(fā)光的圖像進(jìn)行融合，作為原始憑證保存。

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