Western Blot
Guidebook
蛋白免疫印跡實驗指南
Western Blot（WB）蛋白印跡實驗是一種廣泛用于分子生物學的技術(shù)，用于檢測和分析特定蛋白質(zhì)。該技術(shù)通過電泳分離蛋白質(zhì)，然后將其轉(zhuǎn)移到膜上，并利用抗體進行特異性檢測。 為了幫助初學者快速上手并成功實施WB實驗，我們?yōu)榇蠹覝蕚淞说鞍酌庖哂∮泴嶒炛改希渲邪ǎ?/h1>
1.WesternBlot 實驗操作指南
2.Western Blot實驗進階
3.Western Blot疑難排查
1.樣本制備
使用機械或化學方法提取生物樣本中的蛋白質(zhì)， 定量總蛋白，樣品與緩沖液混合，然后裝在凝膠上進行電泳。
注意事項：
> 蛋白質(zhì)在樣品處理過程應(yīng)在低溫下進行，以避免細胞破碎釋放出的各種酶類的修飾（加入合適的蛋白酶抑制劑）。
> 樣品建議分裝成合適的量（比如分裝出 20μL 檢測蛋白質(zhì)定量用），然后 -20°或 -80℃中長期保存，注意不要反復凍融，因為會使蛋白的抗原特性發(fā)生改變。
> 切莫使用不新鮮的上樣緩沖液，同時在處理時應(yīng)注意將樣品與 loading buffer 混合均勻。
2.SDS PAGE 電泳
蛋白樣品被裝載到凝膠上，通過電泳將它們按大小分開。
注意事項：
> 配膠試劑里面的 AP 需要根據(jù)實驗室實際溫度來適量的增加或者減少，比如夏天溫度較高, 自然凝膠速度較快，AP 的量需要適當?shù)臏p少；冬天溫度低，凝膠慢，需要適量的增加。
> 灌膠時掌握好速度，避免氣泡產(chǎn)生（注意濃度越小的膠含水越多，凝固后膠體積縮小越多）。加水液封時速度要很慢，否則膠會被沖變形。
> 所有的蛋白樣品定量一致，體積一致，不夠的用裂解液補足，樣品兩側(cè)的泳道用等體積 的1×Loading Buffer 上樣，Marker也用1×Loading Buffer調(diào)制與樣品等體積，這樣可以避免出現(xiàn)誤差。
> 加樣前可用 5mL 注射器或加樣器先沖洗一下加樣孔。加入下一個樣品前，進樣器需在外槽電泳緩沖液中洗滌 3 次，以免交叉污染。上樣時，小心不要使樣品溢出而污染相臨加樣孔。
> 電泳時間和電壓說法各異。一般電泳至溴酚蘭剛跑出即可終止電泳，進行轉(zhuǎn)膜。為減少蛋白質(zhì)條帶的擴散，上樣后應(yīng)盡快進行電泳，電泳結(jié)束后也應(yīng)直接或者轉(zhuǎn)印。
3.蛋白轉(zhuǎn)膜
將蛋白從凝膠基質(zhì)移動到合成膜支持物上，并與膜相結(jié)合，形成印跡。
注意事項：
> 選擇合適的膜和緩沖液是確保蛋白轉(zhuǎn)印成功的關(guān)鍵。必須通盤考慮蛋白質(zhì)的大小和電荷、轉(zhuǎn)印方法和膜 的結(jié)合特性。
> 切濾紙和膜時一定要戴干凈手套，因為手上的蛋白會污染膜。PVDF 膜使用前用無水甲醇中浸泡 1min~2min。
> 在加有轉(zhuǎn)移液的培養(yǎng)皿里放入裁好的膠、浸過甲醇的 PVDF 膜和濾紙，平衡 10min左右，也是為了除去濾紙和轉(zhuǎn)移膜中的氣泡以及膠上多余的 SDS。
> 用槍頭或移液管在疊層的濾紙上滾動，除去氣泡。注意每疊一層就要用玻璃棒或圓筒試管趕去氣泡，因為一個氣泡的厚度對于蛋白來說都是十萬八千里的。
> 用干凈紗布將疊層上面和周圍的多余緩沖液吸干。這一步很重要，寧可太干也不能太濕，太干容易燒胡，太濕的話多余的緩沖液會導致電流短路，大大降低轉(zhuǎn)移效率，如果同時轉(zhuǎn)好幾條膠的時候更要小心，有一個膠短路就會影響整體的轉(zhuǎn)移效率。
4.封閉
對轉(zhuǎn)印后的膜進行封閉，阻斷膜上未結(jié)合位點，以防止與抗體的非特異性結(jié)合。
注意事項:
> 做磷酸化蛋白的western時使用BSA（牛血清蛋白）作為封閉液。奶粉含有酪蛋白（一種磷酸化蛋白），如果用奶粉，有可能出現(xiàn)背景深的現(xiàn)象。并且脫脂奶粉含磷酸酶，磷酸酶與膜上的磷酸化蛋白接觸可使之去磷酸化，用磷酸化特異性抗體分析磷酸化蛋白時會受到影響。
5.抗體孵育
膜首先與一種特異性針對目標蛋白上一個抗原表位的初級抗體孵育。經(jīng)過幾次洗滌后，隨后會與一個標記的二級抗體孵育，以提供檢測的手段。
注意事項：
> 為減少非特異結(jié)合,可選用封閉液作為一抗和二抗的抗體稀釋液。
> 一抗孵育條件推薦 4°C過夜, 二抗孵育條件為室溫,1h。
> 洗滌液推薦選用 TBST 緩沖液。洗滌時應(yīng)保持適中的搖床速度,避免過快導致膜上的蛋白 或抗體脫落,同時確保洗滌液能夠充分接觸到膜上的每一個角落。在洗滌過程中,適時更換 新的洗滌液以確保洗滌效果。
> 洗滌過程中需要保持膜的濕潤,避免膜干燥導致抗體結(jié)合力下降或蛋白變性。
6.發(fā)光顯影
將膜清洗以移除未結(jié)合的抗體后，使用二抗上的標簽來可視化感興趣的蛋白?？贵w可以標記有產(chǎn)生顏色和光的酶，或者直接用熒光標記來可視化蛋白。
注意事項：
> 采用暗室膠片曝光方法，操作需要盡量熟練，除了要把握曝光時間，還要避免位移（壓片、取片過程中膠片和雜交膜不能有移動）；保留好膠片，作為原始憑證；
> 使用化學發(fā)光成像儀采集圖像，注意采集白光下的圖像，并與發(fā)光的圖像進行融合，作為原始憑證保存。
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